奥维森科技：转录组学测序送样指南

  转录组测序（RNA-seq）是基于第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。转录组测序已经是一项很成熟的技术，但因为样品准备方法的错误或者运输条件的不合理而导致RNA降解事件却时有发生，让很多小伙伴颇为担心。今天，小编就结合既往经验，为大家奉上转录组测序送样指南，希望对大家有所帮助！

  代表性：根据实验目的，选择正真适合取样方案，这将有利于实验结果真实反映样本的本质信息。

  准确性：组织取材部位要准确，正确识别所要研究的组织部位，剔除与研究无关的组织部位，在条件允许的前提下，争取做到实验组与对照组样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致。

  及时性：鉴于RNA结构的特殊性，极易降解，且易受到RNase的影响，因此在样本采集、贮存、运输和制备的过程中应尽可能地在规范操作的同时保持迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

  无污染性：所用实验试剂及器皿需经去RNA酶处理，处理样本的试剂需用RNase-free水配制。

  低温性：所取样本离体后，如有分离步骤在4℃或冰上进行，分离好的样本立即置于液氮中速冻15 min以上，-80℃保存，干冰运输，以避免RNA的降解。

  1） 若开展的实验项目为miRNA的相关实验，请确认采用的总RNA的提取方法保留了小RNA（包括miRNA）。

  2） 避免紫外和反复冻融，不可存放于高温状态和极端pH溶液中（pH6或pH9）。

  1、烧杯中倒入50 mL DEPC水（每解剖一个生物学样本换一次DEPC水）。

  2、从动物活体取材获得组织后，快速用预冷的RNase free水漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组织和毛发等非研究组织（组织样品处理及切割过程在冰上迅速进行；样本离体后，建议在3 min内完成组织取样及液氮速冻，时间过长会导致样本的RNA降解）。

  3、将采集到的组织迅速放入含有预冷的RNase-free水的带螺旋帽的1.5 mL或2.0 mL EP管/冻存管中，立即液氮速冻15 min以上，随后-80℃保存，足量干冰寄送。

  1） 解剖活体特定组织样本时，在含有DEPC水的烧杯中涮干净表面血液（动作迅速，需要在几秒内完成）。

  2） 实验前，将所有用到的烧杯内外表面、锡箔纸表面、镊子、解剖剪和刀片分别用无水乙醇和无纺布蘸RNAzap擦拭一遍；实验过程中，用RNAzap擦拭。

  3） 对需要RNAlater（Ambion，AM7020）及类似保存液保存的样本，请严格按照操作说明进行。

  4） 请勿寄送用裂解液保存的组织样本；动物及临床组织禁止使用锡箔纸、自封袋包裹。

  1、选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位样本，在活体状态下擦净组织表面灰尘和杂质。

  2、取样，迅速放入预冷好的有标记的RNase-free的螺纹冻存管中，或用标记好名称（名称朝外）的锡箔纸包裹好（禁止使用自封袋、一次性PE手套包装样品），液氮速冻15 min，转移到-80℃保存，足量干冰寄送。

  植物组织不可以使用RNAlater保存，因为植物组织含有细胞壁及次生壁，RNAlater不易渗透入组织内部；也勿用Trizol直接浸泡植物组织。

  2） 加入适量1×PBS（DEPC水配置）清洗细胞，200g离心5 min，去上清，清洗2次。

  3） 加入适量的裂解液（TRIzol推荐Ambion），反复吹打至细胞充分裂解（涡旋震荡也可），将裂解液转移至1.5 mL无酶管中，-80℃保存，足量干冰寄送。

  1） 在显微镜下观察培养的细胞，确认细胞的完整性（破裂的细胞会释放出RNA酶降解RNA）。

  3） 加入适量的裂解液（TRIzol推荐Ambion），用移液器充分吹打使细胞充分裂解（细胞与裂解液的混合物形成清亮不粘稠的液体，且没有细胞团块残留），将裂解液转移至1.5 mL无酶管中，-80℃保存，足量干冰寄送。

  1） 细胞样品必须裂解充分后再寄送，勿将冻存的细胞直接寄送，因为细胞冷冻的过程中冰晶很容易刺破细胞，此时破碎的细胞会释放内源性RNase，从而降解RNA。

  2） 进行细胞裂解的操作时，假如发现细胞样品始终粘度很大，说明该细胞样品仍未裂解充分，此时应继续补加裂解液，以100 μL为梯度进行补加，直到样品完全裂解充分。

  3） 细胞样品勿用胰酶消化，胰酶会消化细胞膜上的膜蛋白，导致细胞破裂，破裂的细胞会释放RNase导致RNA降解。

  建议收集时使用PAXgene管，于18-25℃可以保存3天，2-8℃可以保存5天，-20/-80℃可以保存8年；原则上需要-80℃保存，足量干冰寄送。

  1） 每个样本均取新鲜血液1 mL于含有EDTA的抗凝管（紫色管帽）中，混匀。取血过程务必保持洁净。随后，将采集好的全血用移液器以250 μL/管快速分装至1.5 mL离心管中，每管加入750 μL TRIzol LS，混匀，液氮速冻15 min，-80℃保存，足量干冰寄送。

  2） 分离血细胞（约10-15 mL的全血）溶于1 mL TRIzol，混匀，液氮速冻15 min，-80℃保存，足量干冰寄送。

  将使用抗凝管所得的血浆分装至1.5 mL的离心管中，每管1 mL，-80℃保存，足量干冰寄送。

  将未使用抗凝剂分离所得的血清样本分装至1.5 mL的离心管中，每管1 mL，-80℃保存，足量干冰寄送。

  分离得到PBMC后，加入适量TRIzol裂解液，充分裂解好。随后，-80℃保存（每5 mL全血PBMC后加入1 mL TRIzol，不要在PBMC后加入任何冻存液）。

  1） 血液务必在离体两小时内处理好并加入Trizol LS混匀，两小时后血液内mRNA开始降解，后续提取可能会不合格。

  2） 血浆、血清在冰冻状态下应呈淡黄色，或黄色，如果呈红色或淡红色，则为溶血样品，视为不达标，不予提取；室温融化后，其应为淡黄色，或黄色澄清透明的液体，如有絮状不溶物或混浊状态视为不达标，不予提取。

  1、取1 mL对数期（OD600=0.6-0.8）的新鲜菌悬液于1.5 mL无酶管中10000 rpm 4℃离心2 min，充分去除上清，然后重复几次离心或分多管离心收集菌体沉淀，沉淀量需达到1.5 mL离心管的约200 μL处。

  1） 请务必保证菌体培养时无污染，为单一菌种；如菌种经过处理，请通过显微镜确保菌体是否还是活菌状态。

  2） 务必收集对数期菌体，并尽可能地吸净培养基，菌体过老或培养基残留会极度影响后续的提取结果。

  4） 请不要以菌体的形式寄送有毒性、致病性的细菌或者以液体形式（菌液）寄送任何细菌样本。

  5） 菌体若经过特殊处理，会出现RNA条带异常，请送样时在订单里详细备注，否则可能会造成样本的浪费。

  2、样品带回实验室后分装至5 mL或更大体积的离心管或冻存管中（新鲜粪便样品称取200 mg置于5 mL离心管中，即满足单次提取），加2.5 mL Ambion生产的RNAlater® Solution，涡旋混匀，每个样品3-5个重复，4°C过夜。

  3、4°C过夜后，液氮速冻3-5 min，-80°C保存，足量干冰寄送。

  1、选取采样地点，除去土壤表层未分解的凋落物层，先多点（8-10点）采集土壤表面腐殖质层，然后用土壤取样器随机多点（8-10点）分别采集0-10 cm及10-25 cm土层土壤混合样品。

  3、涡旋或手动摇匀，使所有土壤完全润湿，此时Life Gurad Soil Preservation Solution的液面应该高于土样，结合实际条件-20°C或-80°C保存样品，足量干冰寄送。

  1、样品命名：“样品名称”应防止汉字，请采用字母和数字表示，长度控制在8个字符以内，最好能体现出其生物学属性和取样情况。

  2、样品标识：请勿仅使用标签纸进行样品标记，标签纸经液氮冷冻过后易脱落，造成样品混乱；能够正常的使用质量较好的油性笔在样本管上清晰地标记好样本名称，同时也写在标签纸上，贴在管壁，再用透明胶带缠绕一圈，防止脱落。

  3、样本包装：液体样品，建议使用螺旋口的离心管运输，并使用Parafilm密封离心管口。保存时，请将所有样品管装于一个自封袋或冻存盒中，做好标记，以防样品丢失。

  4、样品寄送：干冰运输时，请选用保温性好的泡沫盒（建议壁厚2公分以上）进行样品存放，准备8-10 kg粒状或块状干冰（粉末状干冰较易挥发），以提供低温的样品保存环境。血液类样本从样本收集到送样，建议还是不要超过15天，其他样本则为3个月。在选择与委托快递公司时，应事先确认预计送达的时间，并且在运送过程中随时跟踪货物的情况，您在记录运单号的同时请务必在《技术服务样品提交单》填写您的运单号，以便我们与您一起追踪样品的运输状态。

  如果您目前有合适的样本类型，正在苦恼怎么样开展组学方面的研究，那么欢迎咨询我们奥维森基因哦！返回搜狐，查看更加多